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總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說明書

發(fā)布時間:2023/11/9      點擊次數(shù):1414

總抗氧化能力 (ABTS 法)試劑盒說明書

 

微量法 100T/96S

 

 

注 意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

 

 

研究意義:

 

測定對象中各種抗氧化物質(zhì)和抗氧化酶等構(gòu)成總抗氧化水平。在生物學(xué)、醫(yī)學(xué)和藥學(xué)研究中常常檢測血漿、血清、唾液、尿液等各種體液,細胞或組織等裂解液、植物或中草藥抽提液及各種抗氧化物(antioxidant)溶液的總抗氧化能力。

 

 

測定原理:

 

ABTS 法是使用Z廣泛的間接檢測方法,可用于親水性和親脂性物質(zhì)抗氧化能力測定。ABTS經(jīng)氧化后生成穩(wěn)定的藍綠色陽離子自由基 ABTS+,能溶于水相或酸性乙醇介質(zhì)中,在 734nm 處有最大吸收。被測物質(zhì)加入 ABTS+溶液后,所含抗氧化成分能與 ABTS+發(fā)生反應(yīng)而使反應(yīng)體系褪色。在 734nm 檢測吸光度的變化,并以 Trolox 作為對照體系量化抗氧化物質(zhì)的抗氧化能力。

 

 

自備實驗用品:

 

恒溫水浴鍋、低溫離心機、酶標儀、96 孔板和蒸餾水。

 

 

試劑組成和配制:

 

提取液:液體 120mL×1 瓶,4℃保存。

 

試劑一:液體 24mL×1 瓶,4℃避光保存。

 

試劑二:粉劑×2 瓶,4℃避光保存。

 

 

樣品的制備:

 

(1)     血清、血漿、唾液或尿液等液體樣品

 

血漿(制備時可以使用肝素或檸檬酸鈉抗凝,不宜使用 EDTA  抗凝)4℃,5000rpm 離心

 

10min,取上清待測。血清、唾液或尿液樣品直接用于測定,也可以-80℃凍存(不宜超過

 

30   d)后再測定。

 

(2) 組織樣品

 

按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液)進行冰浴勻漿,然后 10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

(3) 細胞樣品

 

按照細胞數(shù)量(104 個):提取液體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細胞加入 1mL 提取液),冰浴超聲波破碎(功率 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);10000g,4℃離心 10min,取上清,置冰上待測。

 

 

操作步驟:

 

1、 酶標儀預(yù)熱 30min,調(diào)節(jié)波長至 734nm。

 

2、 工作液的配置:臨用前取試劑二一瓶,加入 11mL 試劑一,震蕩混勻 20min 后,靜置,

 

取上清使用。(注意,現(xiàn)配現(xiàn)用)

 

3、操作表(在 EP 管中反應(yīng))

 



空白管

測定管




提取液(μL)

10





樣品(μL)


10




工作液(μL)

190

190




充分混勻,10min 內(nèi)測定 734nm 吸光值,△A= A 空白-A 測定

 

注意:空白管只需測定一次,吸取工作液時不要吸到底部沉淀,若 A 測定小于 0.4,需用提取


液稀釋后檢測。

 

總抗氧化能力計算公式:

 

1、以自由基清除率表示:

 

ABTS 自由基清除率(%)=(A 空白-A 測定)÷A 空白×100%

 

2、以標準曲線上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量表示:

 

標準曲線:y = 0.7021x - 0.0012                R2 = 0.9985                 x:Trolox 濃度(μmol/mL)

y:吸光值差值△A

 

單位定義:以標準曲線上獲得的抗氧化劑 Trolox 的量來表示樣本的 ABTS 自由基清除能力。(1)按樣本質(zhì)量計算

 

總抗氧化能力(μmol Trolox/g 鮮重)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×W) =1.424×(△A+0.0012)÷W

 

(2)按樣本蛋白濃度計算

 

總抗氧化能力(μmol Trolox/mg prot)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×Cpr) =1.424×(△A+0.0012)÷Cpr

 

(3)   按細胞計算

總抗氧化能力(μmol Trolox/104cell)=(△A+0.0012)÷0.7021×V 樣÷(V 樣÷V 樣總×細胞

數(shù)量(萬個))

= 1.424×(△A+0.0012)÷ 細胞數(shù)量(萬個)

 

(3)按液體體積計算

 

總抗氧化能力(μmol Trolox/mL)=(△A+0.0012)÷0.7021 =1.424×(△A+0.0012)

 

V   樣總:加入提取液體積,1 mL;V 樣:反應(yīng)中樣品體積,10μL;W:樣品質(zhì)量,g;Cpr:樣本蛋白濃度,mg/mL

 

注意事項:

 

1.        盡量避免使用在中堿性條件下呈藍色或接近藍色的試劑,否則對本試劑盒的檢測結(jié)果產(chǎn)生干擾。

 

2.        樣品中不宜添加 Tween、Triton 和 NP-40 等去垢劑和 DTT、巰基乙醇等影響氧化還原反應(yīng)的還原劑。


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