硫氧還蛋白過氧化物酶(TPX)活性測定試劑盒說明書
微量法 100T/96S
注 意:正式測定之前選擇 2-3 個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義:
TPX 屬于過氧化物酶家族,在體內(nèi)主要通過還原過氧化氫和一些氫過氧化物來實現(xiàn)抗氧化作用,功能與 GPX 類似,也是谷胱甘肽氧化還原循環(huán)關(guān)鍵酶之一。TPX 普遍存在于各種生物體內(nèi),如酵母、植物、動物、原生動物、寄生蟲、細(xì)菌和古細(xì)菌,在進(jìn)化上高度保守。 TPX 與細(xì)胞增殖、分化、細(xì)胞凋亡及腫瘤發(fā)生調(diào)控密切相關(guān)。TPX 的主要功能包括細(xì)胞脫毒、抗氧化和調(diào)節(jié)由過氧化氫介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和免疫反應(yīng)。
測定原理:
TPX 催化 H2O2 氧化二硫蘇糖醇(DTT),H2O2 的吸收波長為 240nm,通過測定 240nm 吸光度的下降速率,即可計算出 TPX 活性。
自備儀器和用品:
低溫離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)節(jié)移液器、紫外分光光度計/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板(UV板)、和蒸餾水
試劑組成和配制:
試劑一:液體 120mL×1 瓶,室溫保存。
試劑二:液體 20mL×1 瓶,- 20℃保存。
試劑三:液體 2mL×1 支,4℃。
粗酶液提取:
1. 組織:按照組織質(zhì)量(g):試劑一體積(mL)為 1:5~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 試劑一)進(jìn)行冰浴勻漿。8000g,4℃離心 10min,取上清置冰上待測。
2. 細(xì)菌、真菌:按照細(xì)胞數(shù)量(104 個):試劑一體積(mL)為 500~1000:1 的比例(建議 500 萬細(xì)胞加入 1mL 試劑一),冰浴超聲波破碎細(xì)胞(功率 300w,超聲 3 秒,間隔 7 秒,總時間 3min);然后 8000g,4℃,離心 10min,取上清置于冰上待測。
3. 血清等液體:直接測定。
TPX 測定操作:
取微量石英比色皿或 96 孔板,加入 4 μL 上清液,180 μL 試劑二,16 μL 試劑三,迅速混勻后于 240 nm 測定 10s 和 130s 吸光度,記為 A1 和 A2。
TPX 活性計算公式:
a.使用微量石英比色皿測定的計算公式如下
(1). 按蛋白濃度計算
活性單位定義:25℃或者 37℃中,每毫克蛋白每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。TPX(nmol/min /mg prot)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反總÷(Cpr×V 樣)÷T
=573×(A1-A2)÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
活性單位定義:25℃或者 37℃中,每克樣本每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。 TPX 活性(nmol/min/g 鮮重)=(A1-A2)÷ε÷d×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T
=573×(A1-A2)÷W
(3)按細(xì)胞數(shù)量計算
活性單位定義:25℃或者 37℃中,每 104 個細(xì)胞每分鐘催化 1nmol H2O2 降解為 1 個酶活單位。
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