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銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,Cp)測定試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/9      點(diǎn)擊次數(shù):1714

銅藍(lán)蛋白(Ceruloplasmin,Cp)測定試劑盒說明書

                                                  微量法100T/48S

 

 

    意:正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義

銅藍(lán)蛋白是血漿的含銅蛋白,有運(yùn)輸銅的功能,同時(shí)具有氧化酶的活性,是細(xì)胞外液重要的抗氧化劑。

 

測定原理:

銅藍(lán)蛋白催化3,3’,5,5’-四甲基聯(lián)苯胺生成藍(lán)色產(chǎn)物,在645nm處有特征吸收峰,依此可得銅藍(lán)蛋白活性。

 

自備實(shí)驗(yàn)用品及儀器:

天平、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96孔板和蒸餾水。

 

試劑組成和配制:

試劑一:液體10mL×1瓶,4保存。

試劑二:液體7mL×1瓶,4保存。

試劑三:液體15mL×1瓶,4避光保存。(使用前37預(yù)熱)

 

樣本前處理:

1、   血清(漿)等液體樣本:直接檢測。

2、   動(dòng)植物組織樣本:稱取約0.1g組織,加入1mL蒸餾水,進(jìn)行冰浴勻漿。10000g ,4℃離心10min,取上清,置冰上待測。

 

測定操作表:

1、   分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱30min以上,調(diào)節(jié)波長至645nm,蒸餾水調(diào)零。

2、   操作表


空白管

測定管

樣品(µL

30

30

試劑一(µL

90

90

試劑二(µL

60


混勻,37預(yù)熱5min

試劑三(µL

120

120

混勻,37反應(yīng)30min

試劑二(µL


60

混勻,25室溫放置5min,取200µL于微量石英比色皿/96孔板中,測定645nm處吸光值。

ΔA=A測定-A空白。

 

計(jì)算公式:

a.        用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1.按體積計(jì)算

酶活定義:37條件下, 每分鐘每毫升樣品與底物作用吸光度升高0.01為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/mL=ΔA×V反總÷0.01÷V÷T = 33.33×ΔA

 

2.按鮮重計(jì)算

單位定義:37℃條件下,每分鐘每克樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/g鮮重=ΔA×V反總÷0.01÷W×V÷V樣總)÷T = 33.33×ΔA÷W

3.按蛋白濃度計(jì)算

單位定義:37℃條件下,每分鐘每毫克蛋白樣品與底物作用吸光值升高0.01為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/ mg prot=ΔA×V反總÷0.01÷Cpr×V樣)÷T = 33.33×ΔA÷Cpr

 

V樣:0.03 mL;V反總:0.3 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

b.       用微量石英比色皿測定的計(jì)算公式如下

1、   按體積計(jì)算

酶活定義:37條件下 每分鐘每毫升樣品與底物作用吸光度升高0.005為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/mL=ΔA×V反總÷0.005÷V÷T = 66.66×ΔA

2、   按鮮重計(jì)算

單位定義:37℃條件下,每分鐘每克樣品與底物作用吸光值升高0.005為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/g鮮重=ΔA×V反總÷0.005÷W×V÷V樣總)÷T = 66.66×ΔA÷W

3、   按蛋白濃度計(jì)算

單位定義:37℃條件下,每分鐘每毫克蛋白樣品與底物作用吸光值升高0.005為一個(gè)酶活單位。

Cp活力(U/ mg prot=ΔA×V反總÷0.005÷Cpr×V樣)÷T = 66.66×ΔA÷Cpr

V樣:0.03 mLV反總:0.3 mL;T:反應(yīng)時(shí)間,30min;V樣總:加入提取液體積,1mL; Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g

 

注意事項(xiàng):

試劑二和試劑三有一定的毒性和刺激性,請操作時(shí)做好防護(hù)措施。


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