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脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation,LPO)含量試劑盒說明書

發(fā)布時(shí)間:2023/11/9      點(diǎn)擊次數(shù):1392

脂質(zhì)過氧化物(lipid peroxidation,LPO)含量試劑盒說明書

 

微量法 100 /96

 

 

注 意:正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

 

測(cè)定意義:

 

脂質(zhì)過氧化是動(dòng)植物體內(nèi)活性氧(ROS)氧化生物膜的過程,脂質(zhì)過氧化物(LPO)是脂質(zhì)過氧化過程的產(chǎn)物, ROS 與生物膜的磷脂、酶和膜受體相關(guān)的多不飽和脂肪酸的側(cè)鏈及核酸等大分子物質(zhì)起脂質(zhì)過氧化反應(yīng)形成 LPO,使細(xì)胞膜的流動(dòng)性和通透性發(fā)生改變,最終導(dǎo)致細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的改變。因此,LPO 常被作為機(jī)體氧化應(yīng)激的一種指標(biāo),與某些疾病的病理過程,如腫瘤、化學(xué)中毒、感染、炎 癥、自身免疫疾病、動(dòng)脈粥樣硬化(AS)及心腦血管疾病,以及衰老等生理過程密切相關(guān)。

 

 

測(cè)定原理:

 

LPO 在酸性條件下加熱,產(chǎn)生小分子終產(chǎn)物 MDA,MDA 與硫代巴bi妥酸(thiobarbituric acid,TBA)縮合,生成紅色產(chǎn)物,在 535nm 有最大吸收峰。

 

 

需自備的儀器和用品:

 

酶標(biāo)儀、水浴鍋、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、96 孔板、研缽、冰和蒸餾水。

 

 

試劑的組成和配置:

 

提取液:液體 100mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑一:液體 35mL×1 瓶,4℃保存;

 

試劑二:液體 12mL×1 瓶,4℃保存。

 

 

注意事項(xiàng):

 

臨用前注意試劑二是否wan全溶解,如未溶解,可以 70℃-90℃加熱,并振蕩以促進(jìn)溶解。

 

 

LPO 提取:

 

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備:

 

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞:先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi),離心后棄上清;按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量(104 個(gè)):提取液體積(mL)為 500~10001 的比例(建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1mL 提取液),超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞(冰浴,功率 20%或 200W,超聲 3s,間隔 10s,重復(fù) 30 次);8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

組織:按照組織質(zhì)量(g):提取液體積(mL) 15~10 的比例(建議稱取約 0.1g 組織,加入 1mL 提取液),進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min,取上清,置冰上待測(cè)。

 

2、血清(漿)樣品:直接檢測(cè)。

 

 

測(cè)定步驟:

 

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 535 nm。

 

2、 EP 管中依次加入如下試劑

 

 

 

 


測(cè)定管

空白管




試劑一(µL

300

300




樣本(µL

30





蒸餾水(µL


30




試劑二(µL

100

100




 

立即混勻,95℃水浴 40min 后,流水冷卻。3000g 離心 10min,吸取 200µL 上清加入 96 孔板,測(cè)定 535nm 下各管吸光值,記作 A 測(cè)定和 A 空白。ΔA=A 測(cè)定-A 空白。

 

  LPO 含量計(jì)算:

 

96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

 

y = 0.5723x - 0.0076,R2 = 0.9997,x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度 μmol/mL,y 為吸光度。

1、血清(漿)中 LPO 含量的計(jì)算:

 

LPO 含量(nmol/ mL)=ΔA+0.0076÷0.5723×V 標(biāo)÷V ×1000 =1747.3×ΔA+0.0076

 

2、細(xì)菌、細(xì)胞或動(dòng)物組織中 LPO 含量計(jì)算

 

1)按照蛋白濃度計(jì)算

 

LPO 含量(nmol/ mg prot)=ΔA+0.0076÷0.5723×V 標(biāo)÷(Cpr×V )×1000 =1747.3×ΔA+0.0076÷Cpr

 

需要另外測(cè)定,建議使用本公司 BCA 蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒。

 

2)按照樣品質(zhì)量計(jì)算

 

LPO 含量(nmol/g 鮮重)=ΔA+0.0076÷0.5723×V 標(biāo)÷(W ×V ÷V 樣總)×1000 =1747.3×ΔA+0.0076÷W

 

(3 ) 按照細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算:

 

LPO 含量(nmol/104)=ΔA+0.0076÷0.5723×V 標(biāo)÷(500×V ÷V 樣總)×1000

=3.495×ΔA+0.0076

 

V 標(biāo):標(biāo)準(zhǔn)曲線中加入標(biāo)品體積,0.03mL;V 樣:加入樣本體積,0.03 mL;V 樣總:加入提取液體積,1 mLCpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g;500:細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù),500 萬;1000,μmol nmol 換算系數(shù)。


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